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El grupo de trabajo sobre análisis y toxicidad de las prolaminas (WGPAT) mantuvo su 32ª reunión científica anual entre el 27 y el 29 de septiembre de 2018 en la localidad escocesa de Ayr, en el Reino Unido, en las instalaciones de la compañía Neogen Europe Ltd., anfitriona de esta edición. Durante estos días se pusieron en común las novedades clínicas y analíticas relacionadas con la enfermedad celíaca y los alimentos sin gluten, y se celebró un simposio sobre el recientemente secuenciado genoma del trigo. También se comentaron algunos aspectos legales de interés en este campo.

Sesión clínica

Prevalencia de enfermedad celíaca en Italia

El Dr. Carlo Catassi (Universidad Politécnica Della Marche, Ancona, Italia) presentó los resultados del último estudio de prevalencia de enfermedad celiaca que ha llevado a cabo en población pediátrica con una muestra de 4.570 niños de entre 5 y 11 años escogidos al azar en la región italiana de Ancona. De ellos, 27 ya sabían que eran celíacos, lo que supone una prevalencia de enfermedad celíaca diagnosticada del 0,4%. Tras realizar el estudio, se comprobó que la prevalencia real de la enfermedad en este grupo fue del 1,77%, el doble que hace 25 años. Y otro dato importante es que aún hoy, el 76% de los celíacos permanecen sin diagnosticar.

Para llevar a cabo este estudio, primero se realizó el estudio genético HLA de predisposición a enfermedad celíaca, que resultó positivo en el 42% de los sujetos seleccionados. En ellos se analizaron los anticuerpos IgA antitransglutaminasa (TG2) en sangre y en los que resultaron positivos se analizaron también los anticuerpos IgA antiendomisio (EMA). Se realizó biopsia a los que presentaban valores positivos de anticuerpos IgA anti-TG2 pero inferiores a 10 veces el valor normal para confirmar el diagnóstico, mientras que los que mostraban valores 10 veces por encima del valor normal (y eran también positivos para IgA anti-EMA) fueron directamente diagnosticados de EC sin necesidad de biopsia, tal como se recoge en el protocolo actual.

Los rasgos clínicos más destacables en los pacientes diagnosticados fueron el bajo peso y el déficit de hierro como única alteración, y también es reseñable el porcentaje de ellos que tenían algún familiar con enfermedad celíaca.

En algunos casos se observó elevación transitoria de anticuerpos anti-TG2 en los controles de seguimiento de 3 y 6 meses de aquellos sujetos que habían mostrado valores positivos iniciales de estos anticuerpos siendo negativos los anticuerpos anti-EMA. En estos pacientes la enfermedad celíaca no está confirmada y se duda si se trata de una enfermedad celíaca potencial que dará la cara más adelante o si realmente son sujetos completamente sanos.

Enfermedad celíaca potencial

También en Italia destacan los estudios del Dr. Ricardo Troncone (Universidad Federico II, Nápoles), centrado en la caracterización y abordaje de la enfermedad celíaca potencial en niños, que está definida como la presencia de anticuerpos anti-TG2 (ya sea en sangre o depositados en la pared intestinal) en sujetos que muestran predisposición genética y como mucho una leve lesión intestinal sin atrofia con elevación del subtipo gamma-delta de linfocitos intraepiteliales. Estos pacientes pueden o no presentar síntomas y responden positivamente a la prueba de provocación rectal con gluten.

El estudio más reciente llevado a cabo por este investigador concluyó que casi la mitad (166 de 340) de los pacientes diagnosticados de EC potencial seguían en ese estado potencial tras 12 meses de seguimiento a pesar de no haber retirado el gluten de su alimentación. Aproximadamente 1/3 de estos pacientes seguían mostrando valores positivos de anticuerpos anti-TG2 transcurrido un año, en 1/3 habían negativizado y en otro 1/3 se registraron valores fluctuantes en ese periodo.

De cara a decidir cómo actuar con los casos potenciales, comentó que los pacientes con valores bajos de anticuerpos anti-TG2 en sangre, niveles normales de linfocitos intraepiteliales del subtipo gamma-delta en la mucosa intestinal y genética de bajo riesgo probablemente no evolucionarán hacia una EC activa y su estado potencial remitirá de forma espontánea a pesar de no haber dejado nunca de consumir gluten, por lo que podrán hacer dieta libre con total normalidad.

Investigando posibles marcadores que ayuden a pronosticar la evolución hacia una EC activa con atrofia de vellosidades, el único hallazgo que han podido identificar como predictor de futura EC es la elevación muy temprana de los linfocitos intraepiteliales del subtipo gamma-delta. No se observan diferencias entre los casos con elevación de linfocitos intraepiteliales totales y los que no muestran ningún tipo de alteración intestinal en cuanto a su evolución.

Por último, la recomendación que sugiere con los pacientes potenciales depende de su situación clínica. Si están asintomáticos, pueden seguir consumiendo gluten y bastaría con realizar un seguimiento clínico y analítico con revisiones cada 6 meses y hacer biopsia en caso de clara elevación de los anticuerpos o aparición de síntomas. Por el contrario, si tienen síntomas, será necesario instaurar la dieta sin gluten, aunque la EC activa no haya podido ser confirmada.

Test serológico para casos dudosos

El Dr. Knut Lundin (Universidad de Oslo, Noruega) investiga nuevas metodologías de análisis serológico para identificar la enfermedad celíaca en pacientes que están haciendo dieta sin gluten sin haber confirmado previamente el diagnóstico. Está centrado en detectar en sangre células T CD4+ específicas de gluten que se ponen en circulación con destino al intestino tras una prueba de provocación con gluten. La estrategia es administrar gluten durante 3 días y extraer sangre al sexto día tras el inicio de la provocación. Las células T específicas de gluten pueden ser detectadas en el laboratorio al unirse a los denominados tetrámeros, unas moléculas artificiales formadas por proteínas HLA-DQ2 y fragmentos de gluten. Con ello se pueden evitar provocaciones más largas (4-6 semanas es lo habitual) y la realización de biopsias, muy adecuado para pacientes que experimentan síntomas muy acusados cuando reintroducen productos con gluten en su alimentación.

Sensibilidad al gluten no celíaca

La reunión de expertos más reciente sobre sensibilidad al gluten no celíaca (la cuarta desde que se definió esta entidad clínica en 2011) tuvo lugar en diciembre de 2016 en Merano (Italia). Uno de sus participantes, el Dr. Detlef Schuppan (Centro Médico Universitario de Mainz, Alemania), repasó en qué estado se encuentra este problema de salud cuya denominación actual podría ser ‘sensibilidad al trigo no alérgica y no celíaca’ y se definiría como una reacción inmunológica frente a alimentos que contienen gluten una vez descartada la enfermedad celíaca y la clásica alergia al trigo, según las conclusiones de esta reunión.

Se investiga especialmente en pacientes con síntomas de síndrome de intestino irritable en los que la enfermedad celíaca está descartada y en los que no hay evidencias de una alergia al trigo mediada por IgE, al presentar valores negativos de esta inmunoglobulina en sangre y ser negativa también la prueba cutánea de alergia.

En estos pacientes se constata una alta prevalencia de alergia alimentaria no mediada por IgE, caracterizada por el aumento de linfocitos intraepiteliales y eosinófilos en la mucosa duodenal, y por ciertas alteraciones relacionadas con la permeabilidad intestinal. El 80% de ellos tienen una historia familiar de atopia, frente al 20% de la población general.

La novedosa técnica de microscopía láser confocal permite observar en tiempo real que la administración secuencial de leche, soja, levadura y trigo directamente sobre la mucosa intestinal provoca cambios muy rápidos, en menos de 3 minutos, en el 70% de los pacientes estudiados, la mitad de los cuales reaccionan frente al trigo.

El agente responsable de esta reacción no tiene por qué ser el gluten y el componente proteico del trigo más investigado como alternativa son los inhibidores de amilasa-tripsina (ATI, Amylase-Trypsin Inhibitors). Representan el 4% del contenido proteico total en el grano de trigo y son conocidos como el principal alérgeno responsable del asma del panadero, la alergia respiratoria ocupacional más frecuente.

Son proteínas resistentes a la cocción y a la digestión, tienen la capacidad de inducir procesos inflamatorios con activación de células dendríticas y macrófagos tras su interacción con receptores TLR4 en el intestino y se asocian con enfermedades crónicas como la enfermedad inflamatoria intestinal o el lupus eritematoso sistémico.

Se estima que el 10% de la población tiene sensibilidad a ATI y probablemente muchos de ellos no necesitan restringir el gluten en su alimentación para experimentar mejoría, simplemente tendrían que reducir la ingesta de ATI en un 90%, ya que su efecto es dependiente de la dosis. Esto explicaría el efecto beneficioso de la dieta sin gluten en estos pacientes, al ser el trigo una fuente principal de ATI.

Por otro lado, según expuso la Dra. Ombretta Polenghi, de la compañía italiana Dr. Schär (Italia), entre un 10% y un 20% de personas de sociedades occidentales sufre síntomas de intestino irritable, sobre todo mujeres de entre 30 y 50 años, y el principal componente del trigo responsable de estos síntomas son los carbohidratos fermentables conocidos como FODMAP y presentes en los cereales, entre otros alimentos de origen vegetal, lo que también explicaría la mejoría clínica de muchos de estos pacientes cuando hacen dieta sin gluten.

Alergias

Se estima que el 20-25% de la población mundial sufre algún tipo de alergia, y las más comunes se manifiestan como rinitis (20%), dermatitis atópica (10%) o alergia alimentaria (5%). La Organización Mundial de la Salud considera que se trata de uno de los principales problemas de salud pública y ocupa el 4º lugar en términos de morbilidad.

Si nos centramos en la alergia al trigo, afecta al 0,11% de la población europea y es responsable de algo más del 5% de las reacciones graves de anafilaxia en adultos, al menos en Francia, según expuso la Dra. Clélia Villemin, de la compañía INRA, en Nantes. Sus investigaciones muestran que los péptidos desamidados de gliadina pueden comportarse como potentes alérgenos en estudios realizados en ratones en función de la vía de sensibilización, y en humanos su inyección intradérmica provoca importantes síntomas, mientras que la gliadina hidrolizada no tiene ningún efecto y la gliadina no modificada ocupa una posición intermedia como alérgeno.

Comparando la capacidad de sensibilización de los péptidos de gliadina nativa, hidrolizada o desamidada, el Dr. Gregory Bouchard, de la misma compañía, comentó que la desamidada es la más rápida.

Trigo ancestral

Reducir las reacciones inmunológicas adversas que se han comentado es un objetivo que se podría lograr cultivando trigos ancestrales. La especie Triticum monococcum es el primer trigo cultivado por el hombre, hace unos 10.000 años en Mesopotamia. Era diploide (genoma AA) y contenía un gluten menos tóxico que el actual, según estudios de estimulación en cultivos de células y tejidos extraídos de sujetos celíacos y estudios de provocación en pacientes. Estos estudios suelen realizarse con mezclas de péptidos de gluten obtenidos por digestión estándar de la proteína con tripsina y pepsina.

Sin embargo, este tipo de digestión puede influir en el repertorio de péptidos tóxicos que se generan, por lo que la Dra. Carmen Gianfrani (Instituto de Bioquímica de Proteínas, Nápoles, Italia) replicó estos estudios utilizando una digestión más parecida a la que tiene lugar en el tracto digestivo humano. Los estudios de estimulación in vitro mostraron mayor degradación y menor toxicidad en los péptidos derivados del gluten de T. monococcum frente al trigo moderno (Triticum aestivum). Y los estudios de provocación en pacientes mostraron niveles más bajos de interferón gamma y otras citoquinas proinflamatorias en sangre, así como de células T activadas, tras prueba de provocación de 3 días con 12 gramos de gluten diarios. La conclusión es que aunque el trigo ancestral no llega a ser apto para celíacos, podría ser una buena opción para prevenir la enfermedad en grupos de riesgo.

Muerte celular en duodeno en enfermedad celíaca

En relación al proceso patogénico, el Dr. Fernando Chirdo (Universidad Nacional de La Plata, Argentina) expuso los mecanismos de destrucción celular en el intestino de las personas celíacas. Es conocido que la atrofia de vellosidades se debe a la apoptosis de los enterocitos, que la pérdida de la arquitectura del epitelio intestinal es causada por la acción de metaloproteasas, que la hiperplasia de las criptas es un mecanismo de compensación por la pérdida de las vellosidades y que el engrosamiento de la pared intestinal se debe a un desequilibrio de factores de crecimiento.

La apoptosis es un mecanismo de muerte celular programada mediada por proteasas como la caspasa 8, incrementada en el epitelio durante la enfermedad celíaca activa, y la caspasa 3, incrementada tanto en el epitelio como en la lámina propia. El Dr. Chirdo investiga un mecanismo adicional de destrucción celular, la piroctosis, en el que está implicada la caspasa 1 y la gasdermina 10 (elevadas en epitelio y lámina propia), que es propio de infecciones virales y procesos inflamatorios. La elevación de la interleuquina 33 en enfermedad celíaca también apoyaría este mecanismo de destrucción celular.

Sesión analítica

Nuevo método de análisis de gluten en alimentos

La compañía alemana R-Biopharm está desarrollando una versión mejorada de su ensayo ELISA-R5, el único método analítico de detección y cuantificación de gluten en alimentos hoy por hoy aceptado legalmente para este fin. La limitación de este test es que sólo detecta una de las fracciones tóxicas del gluten, las gliadinas, obviando la otra fracción, las gluteninas, cuya proporción es variable según el alimento. El nuevo test en desarrollo va a combinar el anticuerpo R5 con uno o varios anticuerpos específicos para detectar gluteninas, tanto de alto como de bajo peso molecular, en un nuevo ensayo tipo ELISA. En palabras del Dr. Thomas Weiss, de esta compañía, se han ensayado 7 anticuerpos para detectar gluteninas de alto peso molecular (HMW, High Molecular Weight) y 6 para las de bajo peso molecular (LMW, Low Molecular Weight), así como diferentes combinaciones entre ellos y el anticuerpo R5. Podría estar en el mercado en 3 años si es aprobado por el Codex Alimentarius.

Desarrollo de métodos para detectar avena contaminada

Por su parte, la organización AOAC International coordina desde marzo de 2017 el desarrollo y validación de métodos analíticos para detectar la posible contaminación con trigo, cebada o centeno en productos para celíacos elaborados a base de avena. Los ensayos se están llevando a cabo en varios laboratorios utilizando muestras que han sido contaminadas intencionadamente con diferentes cantidades conocidas de gluten extraído de estos cereales, según expuso el Dr. Paul Wehling, de la empresa estadounidense General Mills, miembro integrante de dicha organización.

La importancia de los materiales de referencia

Sea cual sea el método analítico para cuantificar gluten en alimentos, es crucial disponer de un buen material de referencia que permita calibrar fiablemente estos métodos. Su obtención es complicada dada la alta diversidad de los cereales con gluten y la heterogeneidad del gluten que contienen. Uno de los más utilizados es el denominado PWG-Gliadin, propiedad del WGPAT, que fue desarrollado a partir de una combinación de las variedades de trigo más cultivadas en Europa. Las investigaciones de la Dra. Ezter Schall en este ámbito, de la Universidad de Budapest (Hungría), concluyen que lo ideal es utilizar una mezcla de diferentes variedades de cereales mejor que harina o gluten purificado para elaborar el material de referencia. Y entre los factores que influyen en el resultado final de una analítica, por encima del método de análisis empleado, destaca el año de la cosecha de la que se ha obtenido la materia prima para desarrollar el material. De hecho, según expuso la Dra. Zsofia Birrinyi, del Instituto de Agricultura de Budapest (Hungría), factores ambientales como la sequía, el calor extremo u otros agentes estresantes para la planta influyen en la composición de las semillas, las propiedades panificables de las masas (en el caso de granos de cereales) y en el contenido en péptidos tóxicos (si se trata de cereales con gluten).

Necesidad de analizar los inhibidores de amilasa tripsina (ATI)

Los inhibidores de amilasa-tripsina (ATI, Amylase-Trypsin Inhibitors) son una familia de proteínas con función defensiva que representan entre el 2% y el 4% del contenido proteico total en el endosperma del grano de trigo (el gluten representa el 80%). Se investigan por su capacidad para inducir procesos inflamatorios en el intestino y se relacionan con la sensibilidad al gluten no celíaca. Por este motivo se empieza a estudiar más en detalle en qué proporción se encuentran en los distintos cereales. La Dra. Katharina Scherf (Universidad Técnica de Munich, Alemania) ha analizado por espectrometría de masas el contenido en ATI de 8 variedades de trigo común, trigo duro, espelta, Emmer (trigo silvestre tetraploide) y Einkorn (trigo silvestre diploide), todos ellos cultivados en la misma región. Así ha podido demostrar que todos ellos, salvo el Einkorn, poseen un contenido similar en ATI, y que el contenido en ATI no se correlaciona con el contenido total de proteína o de la fracción proteica que agrupa a las albúminas y las globulinas.

Aspectos legales

Las novedades en temas legales fueron expuestas por Johan de Meester y tienen que ver sobre todo con los procesos de hidrólisis y desamidación que emplea la industria alimentaria y también la cosmética en la elaboración de algunos de sus productos a base de trigo.

En lo referente a cosméticos, se describió un caso de anafilaxia en Japón tras el empleo de una loción facial que contenía proteínas de trigo hidrolizadas. A raíz de este caso, se consideran seguros los cosméticos que contengan péptidos hidrolizados con tamaño inferior a 30 kilodalton.

Y en la industria alimentaria, se suele emplear la enzima transglutaminasa (TG2) para reconstruir la matriz proteica en algunos alimentos o para precipitar el gluten y eliminarlo durante la elaboración de cerveza sin gluten. Su empleo se debe a la actividad de transamidación, que entrecruza proteínas entre sí. Pero la TG2 tiene una actividad adicional, la desamidación, que modifica químicamente fragmentos de gluten con alto contenido en el aminoácido glutamina, haciéndolos más fácilmente reconocibles por el sistema inmunológico de los pacientes celíacos, siendo por tanto más tóxicos si son consumidos. Este aminoácido es extraordinariamente abundante en el gluten (30%) y en la soja (18%).

En cuanto a los métodos analíticos basados en el anticuerpo G12, que se postula como alternativa al R5, se han realizado en los últimos años diferentes estudios comparativos y multicéntricos para su validación, aunque no se han dado nuevos pasos para su aprobación desde diciembre de 2016.

Simposio: Genoma del trigo

La primera secuencia completa del genoma del trigo fue publicada en la revista Science el pasado mes de agosto de 2018 después de 13 años de trabajo de más de 200 investigadores de 73 instituciones diferentes repartidas en 20 países, integrantes del Consorcio Internacional para la Secuenciación del Genoma del Trigo. Uno de sus autores, el bioinformático Manuel Spannagl, del Centro de Investigación para la Salud Medioambiental de Munich (Alemania), resumió en qué ha consistido todo este trabajo.

Desde el punto de vista genético, el trigo es altamente complejo. Contiene 21 cromosomas y 17.000 millones de pares de nucleótidos (los eslabones que constituyen la cadena de ADN) que aparecen en 6 copias, de ahí la denominación de trigo hexaploide, fruto de la reunión de 3 genomas diploides por hibridación de diferentes especies ancestrales a lo largo de la historia. En torno al 80% de este genoma contiene secuencias repetidas y el grado de identidad entre los 3 genomas (A, B y D) supera el 97%.

La dificultad radica en ordenar secuencialmente los millones de fragmentos de ADN secuenciados y ubicarlos en el cromosoma correspondiente, para lo que ha sido fundamental tecnología de secuenciación de última generación y las más sofisticadas herramientas bioinformáticas para el ensamblaje de las secuencias.

La variedad escogida para obtener esta primera secuencia de referencia del genoma del trigo fue Chinese Spring. No en vano, en China existe amplia experiencia en estudios citogenéticos, que permiten separar los diferentes subgenomas y sus cromosomas para estudiar y ubicar los genes que contienen, como relató el Dr. René Smulders, de la Universidad de Wageningen (Holanda).

Gracias a esta secuencia de referencia, hoy sabemos, por ejemplo, que las zonas con más variabilidad en los cromosomas son los telómeros (los extremos) y las más conservadas los centrómeros (la zona central). Además, a partir de ahora cualquier secuencia de ADN que se obtenga de cualquier variedad de trigo podrá ser fácilmente ubicada en el lugar que le corresponde dentro del genoma simplemente por homología con la secuencia consenso.

Todo esto va a permitir hacer estudios evolutivos y también estudios comparativos que nos informarán sobre la diversidad genética entre especies y variedades de trigo. Con los datos disponibles hasta la fecha se ha detectado sólo un 10% de diferencias genéticas entre las distintas variedades de trigo cultivadas en la actualidad.

El trabajo continúa, y desde 2011 la iniciativa 10+ Genome Project trabaja en la obtención del ‘pangenoma’ del trigo, es decir, la secuenciación de todas las variedades del trigo para conocer sus genes y diversidad genética. La más importante es la del trigo panadero, hexaploide, obtenida ahora, pero ya se conocían las de los trigos tretraploides Triticum turgidum diccocoides (trigo salvaje conocido como Emmer) y Triticum turgidum durum (especie domesticada conocida como trigo duro y dedicado a elaborar pasta). Estos trigos contienen los genomas A y B y constan de 10.000 millones de pares de nucleótidos. A modo comparativo, la cebada (Hordeum vulgare) es diploide y contiene 7 cromosomas con 5.000 millones de pares de nucleótidos.

En lo referente a los genes de las prolaminas (proteínas constituyentes del gluten), ahora podemos saber cuántas hay y dónde se ubican, y cuántas copias existen de cada una en cada uno de los genomas A, B y D. Esto abre las puertas a mejorar las estrategias de reducción de la toxicidad de las variedades de trigo o de otros cereales que contienen gluten. Los primeros pasos en este sentido comenzaron hace algunos años. El Instituto de Agricultura Sostenible de Córdoba, perteneciente al Consejo Superior de Investigaciones Científicas, ha desarrollado trigos con muy bajo contenido en gliadinas mediante dos estrategias: el silenciamiento de estos genes mediante ARN de interferencia y la más reciente técnica de edición genética CRISPR/Cas9, con lo que logran reducir en un 85% el contenido en gliadinas tóxicas, sobre todo gliadinas omega y algunas gliadinas alfa, que por otra parte se ven compensadas por una mayor cantidad de gliadinas omega.

Y recientemente se ha obtenido también la primera variedad de cebada con muy bajo contenido en gluten, gracias a técnicas tradicionales de hibridación, algo inviable en el trigo dada la enorme complejidad de este cereal, motivo por el que se recurre a técnicas de manipulación genética, que genera controversia. La política actual de la Unión Europea en este sentido es que debe ser considerado organismo modificado genéticamente todo aquel en el que se hayan inducido mutaciones de manera artificial, quedando fuera de esta catalogación las estrategias clásicas de mutagénesis aleatoria.

Como dato final sobre la relevancia de los cereales (con y sin gluten) en la alimentación humana, maíz, arroz, soja y trigo representan el 60% de todo lo que se cultiva en el planeta destinado a la alimentación, con 620 millones de toneladas recolectadas según datos del año 2012.

Autor: Juan Ignacio Serrano Vela. Doctor en Biología.