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La ciudad italiana de Urbino acogió entre el 10 y el 12 de octubre de 2019 la 33ª reunión anual del Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity (WGPAT), en la que se discutieron los problemas relacionados con el análisis de gluten en alimentos y la legislación que les afecta, y se presentaron resultados de tipo clínico fruto de las investigaciones más recientes. Incluyó un Simposio monográfico sobre los inhibidores de amilasa/tripsina (ATI).

Sesión analítica

Análisis de gluten en alimentos

Los métodos vigentes para analizar gluten en alimentos están basados en el anticuerpo R5, que detecta de forma específica las gliadinas del gluten de trigo y fragmentos proteicos similares de cebada y centeno, todos ellos tóxicos para las personas celíacas. La compañía propietaria de estos métodos, la alemana R-Biopharm, comercializa 3 versiones:

• RIDASCREEN® Gliadin (enzimoinmunoensayo ELISA tipo sándwich)
  Método estándar para la detección y cuantificación de gluten.
• RIDASCREEN® Gliadin competitive (enzimoinmunoensayo ELISA tipo competitivo)
  Método adaptado para la detección y cuantificación de gluten hidrolizado.
• RIDAQUICK® Gliadin (ensayo inmunocromatográfico de flujo lateral)
  Método para la detección de gluten mediante tiras reactivas de lectura rápida.

Cualquiera de ellos detecta gliadinas (uno de los componentes del gluten, que representa aproximadamente el 50% del total), pero no gluteninas (el otro componente del gluten, que representa el 50% restante y es potencialmente tóxico). Por ello, el resultado de la cuantificación se multiplica por 2 para estimar la cantidad total de gluten presente en una muestra.

Esto es una fuente de error, porque la relación 50:50 no siempre se cumple, por lo que se sobreestima o se subestima la cantidad real de gluten, según haya mayor proporción de gliadinas o de gluteninas.

Otro problema es que estos métodos sobreestiman el contenido en hordeínas (gluten de cebada) y secalinas (gluten de centeno).

Para solventar estas limitaciones, la empresa ha desarrollado un nuevo método, Total Gluten RIDASCREEN®, consistente en una combinación de anticuerpos que, sumados al R5, son capaces de detectar gliadinas y gluteninas, no sobreestima el contenido de hordeínas y sobreestima en límites aceptables el contenido en secalinas. No reacciona con avena.

La Dra. Katharina Scherf (Universidad de Munich, Alemania) fue la encargada de coordinar el estudio colaborativo para validar este nuevo método, según las directrices de AOAC International, entidad que establece los criterios analíticos que se aplican en seguridad alimentaria, y que traslada tanto a la industria como a los organismos reguladores.

En el estudio participaron 19 laboratorios, que tuvieron que analizar de forma cegada, para después cotejar resultados, las siguientes 7 muestras:

• Harina de avena contaminada con harina de trigo.
• Harina de avena contaminada con harina de cebada.
• Harina de avena contaminada con harina de centeno.
• Harina de avena (con un 2% de contaminación natural).
• Mezcla de harinas de maíz.
• Mezcla de harinas de trigo y centeno.
• Harina de arroz contaminada.

Los resultados fueron satisfactorios y se plantea la posibilidad de solicitar su inclusión como nuevo método oficial de análisis de gluten en muestras alimenticias.

Análisis de gluten en muestras humanas

Desde hace unos años existen técnicas que permiten detectar gluten en las heces y en la orina, lo que en el caso de pacientes celíacos es útil para el control de la dieta sin gluten, ya que detectan con bastante fiabilidad ingestas accidentales (o voluntarias) de gluten.

El Dr. Ángel Cebolla, responsable de Biomedal, compañía sevillana que desarrolló ambos métodos, comentó que una ingesta diaria de 0.5-2 kg de alimentos equivale a 5-15 g de gluten, de los cuales 1-3 g son péptidos tóxicos (GIP, Gluten immunogenic peptides). De ellos, se detecta menos de un 5% en los 0.05-0.5 kg de heces que expulsamos al día y menos de un 0,05% en 0.2-2 litros de orina que se generan diariamente. Con ello plantea qué ocurre con el resto del gluten que se consume y qué efectos tiene en nuestro organismo.

Dilemas a parte, presentó los datos del último estudio llevado a cabo para poner a prueba estos métodos y su capacidad para identificar transgresiones en la dieta sin gluten, así como para revelar el porcentaje de pacientes que hacen mal la dieta sin gluten y en cuantos de ellos no se habría detectado la transgresión con la revisión clínica, con la analítica de anticuerpos o con un cuestionario dietético.

El estudio, desarrollado en Argentina con 53 pacientes celíacos que hacían dieta sin gluten de manera habitual, concluyó que sólo un 11% de los pacientes eran buenos cumplidores de la dieta, al ser negativa la analítica en orina, y en 3 casos en los que se repitió la biopsia por persistencia de síntomas, ésta podría haberse evitado al no detectarse gluten en orina, descartando la ingesta de gluten como causa de los síntomas. Además, se comprobó que los pacientes que no experimentan síntomas al consumir gluten se encuentran entre los que mejor y los que peor hacen la dieta sin gluten.

Obtención de trigo sin gluten

El Dr. René Smulders (Universidad de Wageningen, Holanda) repasó las técnicas de manipulación genética con las que se están obteniendo variedades de trigo con muy bajo contenido en gluten. Se trata del ARN de interferencia (ARNi), que literalmente silencia los genes con los que se construye la parte más tóxica del gluten, representada por las gliadinas, y de CRISPR/Cas9, una revolucionaria manera de editar los genes a conveniencia, que permite tanto eliminar como insertar secuencias de ADN en el lugar deseado. Ésta última es aceptada en muchos países para obtener variedades de plantas sin ser consideradas transgénicas, pero en Europa un trigo obtenido así está catalogado como organismo genéticamente modificado.

Por su parte, las mutaciones al azar, que sí están permitidas en Europa para la mejora genética de plantas, no logran reducir la toxicidad del gluten de trigo por la alta complejidad de su genoma (en el caso de la cebada, por ejemplo, sí que es efectiva esta técnica).

Sesión clínica

Estado nutricional de los niños celiacos

Los pacientes celíacos deben seguir obligatoriamente una dieta sin gluten de manera estricta y de por vida, pero con ello no es suficiente para que el estado de salud sea correcto, ya que la dieta, además de ser sin gluten, debe ser variada y equilibrada. La Dra. Elena Lionetti (Universidad de Ancona, Italia) presentó las conclusiones del último estudio que han realizado en Italia sobre el estado nutricional de pacientes pediátricos, en total 120 niños que llevaban al menos 2 años a dieta sin gluten, y se han comparado con 100 niños sanos.

Los resultados confirman datos ya conocidos: la dieta sin gluten implica un exceso de grasas y un consumo insuficiente de vitamina B9 (ácido fólico), vitamina B12 y fibra si se toman como referencia las ingestas dietéticas recomendadas para cada nutriente. Estas desviaciones se atribuyen a los productos especiales para celíacos.

Al comparar con sujetos sanos se comprueba que los celiacos consumen más grasa, más sal y más azúcares (aunque menos carbohidratos) que los niños sin enfermedad celíaca, y ambos grupos, celíacos y sanos, siguen la dieta mediterránea de manera inadecuada.

Persistencia de síntomas intestinales

Se estima que entre un 10% y un 20% de los pacientes celíacos siguen teniendo síntomas intestinales a pesar de la dieta sin gluten (algunos estudios elevan este rango hasta un 23%-38%). La principal causa que se esgrime es un mal cumplimiento de la dieta sin gluten. Pero si la dieta se hace correctamente, los motivos pueden ser un síndrome de intestino irritable (que afecta al 11% de la población), el consumo de carbohidratos fermentables (FODMAPs), el consumo de productos de avena sin gluten, una sensibilidad extrema en ciertos pacientes o la enfermedad celíaca refractaria.

Para resolver este problema, el Dr. Knut Lundin (Universidad de Oslo, Noruega) ha puesto en marcha en su país un ensayo clínico para estudiar el efecto de una dieta baja en FODMAPs en pacientes celíacos que a pesar de seguir adecuadamente la dieta sin gluten presentan síntomas de síndrome de intestino irritable.

Los sujetos han sido reclutados a partir de una encuesta online anónima en la que se les sondeaba sobre el cumplimiento de la dieta sin gluten (el 88% aseguraban hacer bien la dieta, aunque sólo el 44% lo hacía bien si se tenían en cuenta ciertas conductas de riesgo), los síntomas (el 54% presentaba síntomas digestivos, en el 19% eran severos) o patologías asociadas (tiroiditis autoinmune, diabetes tipo 1 y otras, presentes en el 58% de los casos).

El protocolo, desarrollado por la universidad australiana de Monash, sigue 3 etapas: en la primera se restringe el consumo de FODMAPs, en la segunda se reintroducen los FODMAPs y finalmente se adapta la dieta a cada caso según los resultados de las etapas previas. Cada etapa implica varias semanas y antes de iniciarlas es necesario un periodo de dieta sin gluten bien controlada para comprobar que efectivamente persisten los síntomas intestinales.

Contaminación con gluten

La seguridad alimentaria es fundamental para garantizar un correcto tratamiento de los pacientes celíacos. En Italia se analizó la presencia de gluten en muestras de alimentos consumidos a lo largo de un día por 44 pacientes celiacos de entre 3 y 16 años.

En total se recogieron 371 muestras, que en su mayoría (69%) procedían del hogar familiar. El resto habían sido consumidas en casas de familiares (19%), comedores escolares (9%) y restaurantes (3%). Las muestras aportadas por 36 de los participantes habían sido consumidas en días de diario, y las de los 8 restantes en fin de semana.

Los resultados parciales, correspondientes a las 298 muestras analizadas antes de este congreso, fueron presentados por el Dr. Anil Verma (Universidad de Ancona, Italia). De ellas, sólo una contenía más de 20 mg de gluten por kg (20 partes por millón, ppm), límite máximo permitido para que un producto sea considerado “sin gluten”. 10 muestras contenían entre 5 y 20 ppm y las 287 restantes menos de 5 ppm.

La muestra positiva correspondía a un cracker etiquetado sin gluten que había sido consumido en casa de un familiar durante el fin de semana. Esto no implica que el producto contuviese gluten, lo más probable es que fuese contaminado por accidente durante su manipulación antes de ser consumido.

Teniendo en cuenta la cantidad de alimento ingerido, la cantidad de gluten que se estima que pudo ingerir esta persona a causa de la contaminación está lejos de los 10 mg de gluten totales que se consideran tolerables por día en una dieta sin gluten (un estudio publicado por el grupo del Dr. Catassi en 2008 demostró que la mayoría de los celíacos toleran hasta 50 mg totales de gluten al día, aunque algunos reaccionan con tan solo 10 mg de gluten diarios).

Alergia al gluten

El Dr. Oliver Tranquet (INRA - Instituto Nacional de Investigación Agraria de Nantes, Francia) trabaja en el desarrollo de métodos analíticos para detectar alérgenos en alimentos. En lo que al gluten se refiere, Japón es el país donde más reacciones alérgicas se han producido tras el consumo de alimentos procesados que contienen gliadinas deamidadas, con más de 2.000 casos registrados.

Las fracciones proteicas de gluten con mayor potencial alergénico son las gliadinas gamma y las gliadinas omega 2. Se investiga en el laboratorio su capacidad para inducir respuestas alérgicas, utilizando basófilos (un tipo celular que se activa en procesos alérgicos) y anticuerpos monoclonales de clase IgE desarrollados en ratones para reconocer de manera muy específica las gliadinas deamidadas.

La capacidad estimuladora del alérgeno (gliadina deamidada en este caso) es máxima cuando las regiones proteicas detectadas por los anticuerpos IgE específicos se encuentran muy próximas en el alérgeno, separadas por tan solo 13 aminoácidos, que supone una distancia de 6 nanómetros.

Simposio: 6 años investigando los ATI

El tema elegido para el simposio que todos los años se celebra dentro de esta reunión científica versó en esta ocasión sobre los inhibidores de amilasa/tripsina (ATI), unas proteínas cuya implicación en el proceso patogénico de la sensibilidad al gluten se empezó a investigar hace poco más de 6 años. Las intervenciones de los diferentes ponentes que participaron en esta sesión contribuyeron a conocer un poco más sobre estas moléculas.

¿Qué son los ATI?

La Dra. Colette Larré (INRA – Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias de Nantes, Francia), recordó la composición proteica del grano de trigo, que supone el 20% del aporte proteico total en nuestra dieta:

• 40% Gliadinas alfa, beta, gamma y omega (fracción de gluten soluble en alcohol).
• 40% Gluteninas de alto y bajo peso molecular (fracción de gluten insoluble en alcohol).
• 10% Albúminas.
• 10% Globulinas.

Además, contiene inhibidores de amilasa/tripsina (ATI, Amylase/trypsin inhibitors), una familia de proteínas compactas de pequeño tamaño que tienen una función de defensa frente a parásitos e insectos y suponen un 0.3%-0.4% del peso seco de la harina integral de trigo.

Según expuso el Dr. Massimiliano Cuccioloni (Universidad de Camerino, Italia), estos ATI forman parte del grupo de antinutrientes del trigo, junto a los inhibidores de lipasas y de otras amilasas y proteasas, sustancias que interfieren en la digestión de los alimentos, dificultando la absorción de nutrientes. A pesar de ello, el trigo es muy nutritivo: aporta entre el 20% y el 50% de las calorías diarias, además de aminoácidos esenciales, vitaminas, minerales, fitoquímicos y fibra.

Para estudiar el contenido en ATI de diferentes variedades de trigo, la Dra. Colette identificó como antígenos más relevantes en esta familia proteica los ATI CM3, CM16, CM-like y 0.28. Al ser inyectados en ratones, éstos quedan inmunizados y generan anticuerpos específicos que después pueden ser utilizados para detectar la presencia de ATI en distintas variedades de trigo. Así se ha podido detectar la presencia de los ATI CM3 y 0.28 en las variedades más modernas de trigo, Triticum aestivum y Triticum durum, mientras que variedades más antiguas contienen sólo CM3 (es el caso de Triticum turgidum) o ninguno de ellos (Triticum monococcum).

Estos ATI son capaces de promover la desgranulación de basófilos (células efectoras en los procesos alérgicos) y la sensibilización inmunológica con la inducción de inmunoglobulinas G (IgG) específicas. El antígeno CM3 es el más potente estimulador del sistema inmune en la familia de los ATI, pero no es el componente más abundante dentro de la fracción proteica CM que lo aloja, mientras que 0.28 es el más relevante como inductor de alergia.

¿Qué relación tienen los ATI con la salud?

El Dr. Detlef Schuppan (Centro Médico Beth Israel Deaconess de Boston, Estados Unidos), pionero en el estudio del papel de los ATI en enfermedades inflamatorias, comentó que el 15% de la población en las sociedades que consumen trigo sufre enfermedades inflamatorias asociadas a este cereal, que incluyen la enfermedad celíaca (1%), la alergia atípica al trigo no causada por gluten (5%) y la sensibilidad a los ATI (10%). Las dos primeras implican activación de la respuesta inmune adaptativa, mientras que la tercera activa la inmunidad innata a través del receptor TLR4 (Toll-like receptor 4)

El receptor TLR4 está presente en la superficie de ciertas células inmunitarias, como monocitos, macrófagos y células dendríticas, y es clave en el reconocimiento de bacterias invasoras. Su activación, que ocurre tras su unión a bacterias, promueve una reacción inflamatoria de carácter defensivo.

En el año 2012, el grupo del Dr. Schuppan publicó los resultados de unas investigaciones que demostraban que los ATI podían unirse a los receptores TLR4 y activarlos provocando inflamación. Los ATI más representativos en este sentido son CM3, CM17, 0.19 y 0.53.

En el laboratorio se puede estudiar la capacidad de los ATI para estimular células inmunitarias que poseen el receptor TLR4, como las células dendríticas. Al testar de esta manera el potencial inmunogénico de los ATI obtenidos de más de 180 variedades de trigo cultivadas en 3 localizaciones diferentes se comprueba que existen grandes diferencias, independientemente de la variedad o de la localización del cultivo.

Estudios proteómicos del Dr. Cuccioloni en 15 variedades de trigo también detectan una gran variabilidad, cada variedad de trigo contiene su propio repertorio de proteínas ATI, que difieren en tipo y en cantidad. Estudios cromatográficos, en cambio, sí detectan algunos puntos en común entre ellas, independientemente de la abundancia de cada tipo de ATI en cada variedad.

Factores ambientales, continúa Schuppan, como la contaminación atmosférica o los fertilizantes pueden influir en la capacidad de los ATI para desencadenar reacciones inmunológicas indeseadas, y éstas se pueden ver favorecidas por un aumento de la permeabilidad intestinal.

En la actualidad se investiga el papel de los ATI y los posibles beneficios de dietas libres de ATI en diferentes enfermedades crónicas de naturaleza inflamatoria o autoinmune, como la esclerosis múltiple, la colitis ulcerosa, NASH (una forma de hígado graso no alcohólico) y otros trastornos, como el síndrome metabólico.

¿Cómo actúan los ATI?

Como se ha comentado, la función de los ATI es inhibir las enzimas digestivas amilasa y tripsina de los parásitos e insectos que atacan a la planta, que así se defiende de ellos al impedir que digieran los alimentos y se nutran. Pero también, de manera indeseada, pueden provocar inflamación intestinal en personas que consumen trigo, al unirse a los receptores TLR4. El mecanismo de acción de los ATI en ambas situaciones fue detallado por el Dr. Cuccioloni.

Según sus investigaciones, los ATI se unen a los sitios catalíticos de las enzimas amilasa y tripsina impidiendo su acción digestiva. Ha conseguido demostrar que una misma molécula ATI puede unirse e inactivar a ambas enzimas a la vez, ya que interacciona con ellas con regiones diferentes de su estructura. Además, ha probado que la capacidad inhibitoria es 10 veces más potente en la amilasa que en la tripsina.

En relación al receptor TLR4, ha demostrado que los ATI se unen a él sin interferir en la interacción de este receptor con las moléculas MD2 y CD14, necesarias para la activación de la cascada inflamatoria. En sus experimentos ha observado que al digerir el ATI CM3 con pepsina se genera un péptido que se une al receptor TLR4 pero no induce inflamación y además impide que se unan otros ATI. Así, se ha calculado que si la concentración de este péptido es 100 veces superior a la concentración de ATI, se podría prevenir la inflamación que éstos provocan en condiciones normales.

¿Por qué aumenta la sensibilidad al trigo?

Para dar respuesta a esta pregunta, la Dra. Katharina Scherf (Universidad de Munich, Alemania) está estudiando 60 variedades de trigo cultivadas desde 1890 hasta 2010, a razón de 5 variedades por década, con el fin de descubrir si existen diferencias en los cultivos que expliquen esta mayor prevalencia de los problemas de salud asociados al consumo de trigo. Mientras se obtienen los resultados, que aún se están analizando, las explicaciones que se barajan son muchas y diversas: diferentes prácticas agrícolas relacionadas con el cultivo y la selección de variedades, mejor conocimiento médico de las patologías asociadas o mayor vulnerabilidad de la población humana asociada a la menor incidencia de infecciones, a alteraciones de la permeabilidad intestinal, a cambios en la composición microbiana del intestino o a cambios en los hábitos de alimentación.

Autor: Juan Ignacio Serrano Vela. Doctor en Biología.
Servicio de Investigación y Formación. Asociación de Celíacos y Sensibles al Gluten. Madrid.