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La reunión anual del Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity (WGPAT) tuvo lugar este año de manera virtual y fue retransmitida desde las instalaciones que la compañía Dr. Schär, anfitriona de la presente edición, tiene en la ciudad italiana de Postal. Las sesiones clínicas y analíticas habituales fueron completadas en esta ocasión con un simposio sobre los factores desencadenantes de la enfermedad.

Sesión analítica

Trigo modificado para reducir su contenido tóxico en gluten

La elaboración de productos sin gluten a partir de cereales con gluten requiere eliminar las fracciones tóxicas de esta proteína. Para ello se pueden aplicar tratamientos enzimáticos durante la elaboración del producto, se pueden administrar fármacos o complementos alimenticios con enzimas que degraden el gluten al consumir el producto, se puede recurrir a la ingeniería genética para neutralizar la expresión de los genes que dan lugar a las fracciones tóxicas del gluten en los cereales que lo contienen o se puede intentar obtener variedades no tóxicas de los cereales con gluten a base de cruzamientos.

Estrategias de este tipo han permitido obtener cebada sin gluten para elaborar cerveza a base de acumular deleciones (mutaciones que implican pérdida de material genético) en los genes del gluten. Esto no supone un problema para la elaboración de la cerveza puesto que el gluten no juega ningún papel en el proceso, y es relativamente sencillo de lograr al tener la cebada un genoma diploide (dos juegos de cromosomas), tal como explicó el Dr. René Smulders (Universidad de Wageningen, Países Bajos).

En el caso del trigo es mucho más complejo. Su genoma es hexaploide (6 juegos de cromosomas) y además parte del gluten (las gluteninas) es fundamental en el proceso de panificación, lo que implicaría eliminar selectivamente las gliadinas (que son además la fracción más tóxica) si afectar a las gluteninas.

Con el trigo se ha logrado obtener variedades sin el gen que da lugar a la gliadina omega-5. Esto no evita la enfermedad celíaca (quedan muchas otras gliadinas activas) pero previene una reacción alérgica muy grave (y poco frecuente) provocada por esta fracción proteica. Y en Estados Unidos se comercializa una variedad patentada de trigo con bajo contenido en gluten, GoodWheat^TM, pero no es apta para celíacos. No se vende en Europa.

Trigo sin ATI para conocer su papel en la sensibilidad al gluten no celíaca

La fracción proteica del grano de trigo contiene principalmente gluten, que es la proteína de reserva nutritiva del cereal, pero también contiene, en menor proporción, enzimas hidrolíticas (amilasas, lipasas, proteasas), enzimas oxidativas (peroxidasa) e inhibidores enzimáticos de enzimas hidrolíticas. A este último grupo pertenecen los inhibidores de amilasa y tripsina (ATI, amylase-trypsin inhibitors), que representan el 4% del contenido proteico en el grano de trigo y son responsables de ciertas alergias a este cereal. Se investiga su papel como inductores de la sensibilidad al gluten no celíaca, según expuso la Dra. Stefania Masci (Universidad de Tuscia, Italia).

La manipulación genética del trigo con las técnicas de ARN de interferencia y de edición genética CRISPR-Cas9 ha permitido obtener variedades con un muy bajo contenido en ATI, con dos fines: reducir el impacto de reacciones adversas en pacientes alérgicos al trigo e investigar su papel en la sensibilidad al gluten no celíaca.

Las líneas de trigo modificado, al ser enfrentado en el laboratorio su contenido proteico con sueros extraídos de pacientes alérgicos, han demostrado ser menos reactivas, aunque se han producido 3 resultados inesperados:

1. Los inhibidores de tripsina siguen activos, es decir, no se ha logrado silenciar sus genes.
2. Los genes que dan lugar a las gluteninas de alto peso molecular (HMW-G, high molecular weight glutenins) del gluten han sido silenciados, probablemente debido a su similitud, insospechada hasta el momento, con los genes ATI.
3. Al hacer el mismo experimento con el trigo duro (variedad tetraploide de trigo, más antigua que el trigo hexaploide moderno) se han activado los ATI conocidos como 0.28, que se creían inexistentes en esta variedad y ahora se sospecha que estaban presentes como pseudogén (gen no funcional) que ha recuperado su función tras la edición genética.

El siguiente paso en esta investigación será comprobar en el laboratorio si las fracciones proteicas de las líneas de trigo modificado son capaces o no de estimular las células inmunitarias de pacientes con sensibilidad al gluten no celíaca. Si no las estimulan, se podría concluir que los ATI efectivamente están implicados en la aparición de esta patología.

Desarrollo de un nuevo estándar de gluten para calibrar métodos analíticos

Los métodos analíticos que detectan y cuantifican gluten en muestras de alimentos deben ser calibrados con un estándar de gluten representativo de trigo, cebada y centeno. No existe ninguno certificado para este fin y el que se usa fue desarrollado por el Prolamin Working Group a partir de las 28 variedades más representativas de estos cereales cultivadas en Europa. Se llama PWG Gliadin, fue desarrollado en 1989 y sólo queda material para 4 años. Reproducirlo es inviable porque las variedades originales han evolucionado y el resultado no sería el mismo. La Dra. Katharina Scherf (Universidad Técnica de Munich, Alemania) lidera este reto.

Por este motivo, desde hace unos años se investiga la mejor estrategia para obtener un nuevo material de referencia para calibrar los métodos analíticos. Para ello se ha hecho un muestreo mundial y se ha comenzado eligiendo las 23 variedades de trigo más cultivadas en la actualidad, en Australia, Austria, Canadá, China, Francia, Alemania, Hungría, Rusia y Reino Unido. De ellas, finalmente se han seleccionado 5 de 4 continentes: América (Estados Unidos), Europa (Austria y Reino Unido), Asia (China) y Oceanía (Australia).

Se ha analizado el contenido en gluten utilizando como muestras de partida la harina, el gluten purificado a partir de la harina, o las gliadinas purificadas a partir del gluten. No se han observado grandes diferencias entre las distintas variedades de trigo para cada tipo de muestra analizada, más allá de las esperables. Queda descartado el empleo del grano completo por su menor estabilidad y está por decidir si emplear harina o gluten purificado para la elaboración del material de referencia (no hay diferencia entre gluten o gliadinas).

Ahora se están seleccionando las variedades más representativas de cebada (127 variedades preseleccionadas) y centeno (57 variedades preseleccionadas).

En busca del origen de los péptidos tóxicos del gluten

El gluten es una proteína muy compleja construida a partir de más de un centenar de genes que, tras ser parcialmente digerida y después modificada (deamidada) por la enzima transglutaminasa (TG2) en el intestino, genera péptidos con secuencias concretas de aminoácidos (epítopos) que tienen gran capacidad para hacer reaccionar el sistema inmunitario de las personas celíacas. Para identificar a qué proteínas del trigo pertenecen dichos epítopos, se ha puesto en marcha una iniciativa novedosa. Consiste en buscar los epítopos de gluten descritos hasta el momento, que están registrados en bases de datos destinadas a investigación, y “rebobinar” el proceso de deamidación que los generó, obteniéndose así la secuencia original del péptido de gluten, previa a la modificación llevada a cabo por la TG2. Así se pueden localizar fácilmente en el proteoma del trigo, que es una recopilación de todas las proteínas que expresa este cereal y que aparece recopilado también en bases de datos destinadas a investigación. Lo presentó la investigadora Marie Lay, de la Universidad Técnica de Munich (Alemania).

Sesión clínica

Nuevo marcador para el diagnóstico la enfermedad celiaca

Un nuevo subtipo celular puede servir como marcador de lesión intestinal. Se trata de las células T productoras de interleuquina 4 (IL-4). Su baja frecuencia en la mucosa intestinal se asocia con atrofia vellositaria y por tanto con EC activa. Los sujetos sanos y los pacientes con EC potencial, en cambio, tienen una elevada proporción de estas células.

Si este hallazgo se suma a otro marcador ya conocido, los linfocitos intraepiteliales con receptor TCR del subtipo gamma-delta, que en este caso se encuentran elevados en EC activa y reducidos en EC potencial y en sujetos sanos, se dispone de una herramienta adicional para el diagnóstico. Ambas se pueden analizar por citometría de flujo.

Queda por investigar ahora el papel de estas células T productoras de IL-4, tarea en la que se centran las investigaciones de la Dra. Carmen Gianfrani en el Instituto de Bioquímica de Proteínas del Centro Nacional de Investigación de Italia, con sede en Nápoles. Se postula si tienen que ver con la presencia de células reguladoras de la respuesta inmune, que están presentes bajo el epitelio intestinal de los sujetos sanos o con EC potencial, pero ausentes en pacientes con EC activa. También está por ver qué tipo de antígeno las estimula, si participan en la reacción inflamatoria inducida por el gluten y cómo evolucionan en pacientes celíacos cuando inician la dieta sin gluten.

La dieta sin gluten en la infancia

Diversas investigaciones recientes aseguran que algunos pacientes celíacos adultos consumen cantidades demasiado elevadas de gluten al día. Estas ingestas no siempre son detectadas por los cuestionarios dietéticos o por los controles serológicos de anticuerpos, pero pueden estar detrás de los síntomas persistentes que siguen presentando algunos pacientes, o incluso del daño intestinal que perdura transcurridos varios años desde el diagnóstico en algunos casos, en palabras del Dr. Carlo Catassi (Universidad Politécnica delle Marche de Ancona, Italia).

Para evaluar estos riesgos en la infancia, se analizaron 448 muestras de alimentos consumidas en un periodo de 24 horas por 69 pacientes celíacos pediátricos. Se tuvo en cuenta la cantidad consumida de cada alimento en el que se detectó gluten. Se comprobó que todas las muestras analizadas contenían menos de 20 mg de gluten por kg de producto (<20 partes por millón, ppm), siendo por tanto consideradas “sin gluten” según la legislación vigente. No se observaron grandes diferencias en el consumo de estas pequeñas cantidades de gluten según el lugar (hogar, casa de familiares, colegio, etc.) o el día de la semana.

Ensayos clínicos con fármacos para la enfermedad celíaca

El Dr. Detlef Schuppan (Centro Médico Beth Israel Deaconess de Boston, Estados Unidos) hizo un repaso rápido por las terapias farmacológicas que se están ensayando con pacientes celíacos y se centró en la terapia oral con enzimas que degradan gluten (glutenasas), el bloqueo del aumento de la permeabilidad intestinal, la inhibición de la enzima transglutaminasa tisular (TG2) y las terapias inmunológicas de inhibición de la inflamación o de inducción de tolerancia (vacunas).

Todos estos ensayos requieren intervenciones de al menos 6 semanas con el fármaco experimental durante la fase 2 y marcan como objetivo principal la mejora cualitativa del daño intestinal durante las fases 2 y 3. Persiguen ser capaces de neutralizar los efectos de ingestas de entre 1 y 3 gramos de gluten al día.

El bloqueo del aumento de la permeabilidad intestinal se ensaya en fase 3 y es la estrategia farmacológica más avanzada. El fármaco está basado en el acetato de larazótido (INN-202, antes denominado AT-1001) y evita el contacto entre el gluten y el sistema inmunitario al impedir que los fragmentos de gluten atraviesen la pared intestinal.

Sobre la terapia oral con glutenasas, la administración del fármaco Latiglutenasa (IMGX003, antes denominado ALV003), que combina una enzima bacteriana y otra de la cebada, no mostró diferencias con el placebo durante la fase 2, y el fármaco Kuma030, diseñado a partir del anterior pero con una actividad 100 veces superior, se ensaya en fase 2.

Por su parte, el fármaco ZED1227 bloquea la enzima TG2 de manera irreversible, con lo que previene la modificación química del gluten (deamidación) que da lugar a péptidos mucho más tóxicos para las personas celíacas. Tiene 100 veces más afinidad por la transglutaminasa intestinal que por otras transglutaminasas, por lo que no se esperan efectos secundarios fuera del intestino. Está pendiente de iniciar la fase 2.

En el terreno inmunológico, el fármaco AMG714 es un anticuerpo monoclonal que bloquea la acción de la interleuquina 15 (IL-15), un mediador inmunológico con gran capacidad proinflamatoria que resulta clave en la enfermedad celíaca. Se ensaya en fase 2 su capacidad para neutralizar ingestas accidentales de gluten en pacientes celíacos adultos.

Y en el campo de las vacunas se han ensayado dos estrategias. Una con la vacuna NexVax2, que contiene los 3 fragmentos de gluten más tóxicos identificados hasta la fecha y se inyectan por vía intradérmica de forma periódica para inducir tolerancia inmunológica en pacientes celíacos con el marcador genético HLA DQ2. Los resultados de los ensayos en fase 2 no fueron satisfactorios y se interrumpieron el pasado año.

La otra vacuna, más novedosa, está basada en nanopartículas que contienen fragmentos de gluten y que inyectadas en sangre se dirigen a los centros de control inmunológico, donde liberan su contenido e inducen tolerancia inmunológica frente al gluten. Se llama TAK-101 (antes conocida como TIMP-Glia) y va a iniciar la fase 2 en breve.

Simposio: ¿Qué factores desencadenan la enfermedad celíaca?

¿El péptido p31-43 del gluten?

La reacción inmunitaria que sufren las personas celíacas en respuesta al gluten implica tanto a la inmunidad innata (respuesta temprana e inespecífica) como a la inmunidad adaptativa (respuesta tardía, específica). Está muy bien descrito el mecanismo de respuesta adaptativa, cuyo principal desencadenante es el fragmento no digerido de gluten conocido como péptido 33mer, aunque hay muchos otros péptidos derivados de las diferentes gliadinas que componen el gluten con capacidad para iniciar, potenciar o perpetuar dicha respuesta.

Sin embargo, el mecanismo de activación de la respuesta innata es menos conocido y en ello se centró el Dr. Ricardo Troncone (Universidad Federico II de Nápoles, Italia). Se investiga como principal candidato en su puesta en marcha el péptido p31-43 derivado del gluten y se sospecha que las personas celíacas son más vulnerables a sus efectos en el intestino, en el que se activan fácilmente fenómenos inflamatorios que favorecen la pérdida de tolerancia inmunológica frente al gluten y la activación de la inmunidad adaptativa.

En cultivos de laboratorio con células intestinales derivadas de cáncer de colon (denominadas células Caco2, muy utilizadas en investigación), se observan ciertos cambios estructurales y funcionales inducidos por el péptido p31-43 relacionados con el estrés celular, entre ellos la activación de la enzima transglutaminasa (TG2) y la producción tanto de interleuquina 15 (IL-15) como de su receptor. También promueve la denominada ruta mTOR, relacionada con la supervivencia y proliferación celular. En cultivos de laboratorio con células intestinales derivadas de pacientes celíacos se comprueban efectos similares tras el contacto con el péptido p31-43.

El mecanismo de acción de este péptido parece estar relacionado con las rutas de endocitosis, dedicadas a la internalización y destrucción de sustancias extracelulares, que se muestran alteradas en los casos estudiados. Se postula que las personas con enfermedad celíaca tienen alteradas de base estas rutas en las células intestinales, lo que les vuelve vulnerables al péptido p31-43 del gluten y puede favorecer el desarrollo de la EC.

¿Las infecciones víricas?

El papel de las infecciones virales como desencadenantes de la enfermedad celíaca se investigada desde hace años. Rotavirus, adenovirus, astrovirus y reovirus son algunos de los candidatos propuestos, y los estudios genéticos masivos que se realizan en busca de marcadores de la enfermedad apuntan también a fallos en la respuesta inmune antiviral que favorecerían la pérdida de tolerancia inmunológica frente a proteínas de los alimentos. Así lo resumió la Dra. Valentina Discepolo (Universidad Federico II de Nápoles, Italia).

Se intenta averiguar si las infecciones virales repetidas aumentan el riesgo de desarrollo de la enfermedad, si influye el tiempo que transcurre entre la infección viral y la introducción de gluten en la dieta o si es posible prevenir la enfermedad mediante vacunación frente a estos virus o adaptando la edad de introducción de gluten en la dieta en función de la ocurrencia de posibles infecciones virales.

¿Las infecciones bacterianas?

En el caso de las bacterias se postula que su relación con la pérdida de tolerancia inmunológica frente al gluten puede deberse a que fragmentos proteicos bacterianos procesados por las células inmunitarias durante la defensa antibacteriana natural poseen secuencias idénticas o muy parecidas a algunos péptidos derivados del gluten y ello podría favorecer que células inmunitarias sensibilizadas frente a bacterias reaccionen frente al gluten activando los procesos inflamatorios propios de la enfermedad. Se han encontrado secuencias muy similares a los péptidos de gluten que hacen reaccionar el sistema inmunitario de las personas celíacas en bacterias de los géneros Pseudomonas y Bordetella, según comentó el Dr. Frits Koning (Universidad de Leiden, Países Bajos).

Recordando el papel de las células T CD4+

Para resumir algunos conceptos básicos y bien demostrados en la patogenia de la enfermedad celíaca (EC), el Dr. Knut Lundin (Universidad de Oslo, Noruega) recordó que los péptidos derivados del gluten son presentados por proteínas HLA DQ2 o DQ8 a células T, que los reconocen de manera muy específica a través de su receptor superficial (TCR, T cell receptor), activándose y convirtiéndose en una célula T específica de gluten capaz de poner en marcha una potente respuesta inflamatoria y autoinmune.

Se estima que entre un 0,5% y un 1,8% de las células T presentes bajo el epitelio intestinal de las personas celíacas son específicas de gluten, y se ha demostrado que pueden permanecer allí durante décadas, hasta 30 años después de iniciada la dieta sin gluten, lo que explicaría que una persona celíaca no deje de serlo aunque haga dieta sin gluten, y que reaccione rápido cuando vuelve a consumir gluten. Estas células solo se encuentran en la mucosa intestinal y están presentes en todos los pacientes.

Por último, es muy interesante destacar que pese a la enorme variedad de péptidos de gluten que se generan durante la digestión (que además son diferentes de unas personas a otras) y pese a la enorme diversidad de células T (definida por su TCR) que posee un sujeto sano como parte de su armamento defensivo natural (que también varía de unas personas a otras), una vez desarrollada la EC, el estudio de sus células T y de los péptidos de gluten que reconocen muestra una gran uniformidad entre diferentes sujetos celíacos.

Aspectos legales

En el apartado legal, Hertha Deustch, delegada de la Asociación de Celíacos de Europa (AOECS, Association of European Coeliac Societies), que es miembro observador desde 1992 en el Codex Alimentarius (entidad dependiente de la FAO/OMS y encargada de elaborar los estándares de calidad relacionados con la alimentación que se implementan en la legislación de los diferentes países) expuso las novedades relacionadas con el gluten y la enfermedad celíaca (EC). Comentó que todos los estándares que afectan a la EC han mejorado en el último año.

El comité sobre seguridad alimentaria (CCFH, Codex Committee on Food Hygene) está trabajando para mejorar el control y etiquetado sobre la presencia de alérgenos para prevenir reacciones alérgicas, tanto las de respuesta rápida (mediadas por IgE) como las de respuesta retardada (no mediadas por IgE). Los cereales con gluten están incluidos entre los grupos de alimentos sujetos a estos controles.

Y el comité de nutrición y alimentos para necesidades dietéticas especiales (CCFSDU, Codex Committee on Nutrition and Foods for Special Dietary Uses) se encuentra a la espera de recibir resultados sobre nuevos métodos analíticos para detectar y cuantificar gluten en alimentos, previstos para el próximo año. El método vigente es el ensayo ELISA basado en el anticuerpo R5.

Autor: Juan Ignacio Serrano Vela. Doctor en Biología.
Servicio de Investigación y Formación. Asociación de Celíacos y Sensibles al Gluten. Madrid.