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El Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity (WGPAT) celebró su reunión anual de manera virtual entre el 31 de marzo y el 1 de abril de 2022. Como siempre, aunque en un formato más reducido, se repasaron algunos aspectos clínicos y analíticos relacionados con la enfermedad celíaca (EC) y la detección de gluten en alimentos, siendo este último el tema central del simposio que acogió esta reunión, y se mostraron los últimos avances legislativos en relación con el análisis y etiquetado de alimentos sin gluten.

Abordando los síntomas intestinales

El Dr. Twan America (Universidad de Wageningen, Países Bajos) habló sobre el proyecto WOW, Well On Wheat?, desarrollado entre 2017 y 2021 por un consorcio internacional de investigadores con el objetivo de estudiar la composición del trigo, las harinas, las masas y los productos horneados y su relación con la salud. En concreto perseguía averiguar por qué los productos derivados del trigo causan síntomas digestivos a personas que no tienen EC. Se seleccionó el trigo panadero, el trigo espelta y el Emmer, una variedad antigua de trigo, para su estudio. El equipo del Dr. America se centró en el análisis proteómico de harinas, masas y panes, para lo que ensayaron dos métodos de extracción de proteínas para su análisis. Su principal resultado fue que las fracciones de gluten más abundantes en todos los tipos de muestras analizadas fueron las gliadinas alfa y omega, las que concentran la mayor toxicidad para las personas con EC. Y las mayores diferencias entre masas, harinas y panes tenían que ver con su contenido en fructanos, ácidos orgánicos, aminoácidos y azúcares.

Por su parte, la investigadora Melanie Lavoignat (Instituto Nacional de Investigación sobre Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente -INRAE- de Francia) estudia si la digestibilidad de los panes tiene que ver con la variedad de trigo utilizada como materia prima. Para ello, estimó la proporción de proteína no digerida y no absorbida calculando la relación entre la cantidad de nitrógeno ingerido y la cantidad de nitrógeno eliminado tras un proceso de digestión de 2 horas. Lo hizo con panes elaborados a partir de 17 variedades de trigo, unas antiguas y otras más modernas, cultivadas en 2 regiones diferentes. Concluyó que existen diferencias en la digestibilidad de los panes que son atribuibles al perfil genético de cada variedad, pero ésta no se ve afectada por la región de cultivo ni por la antigüedad de la variedad.

El Dr. Knut Lundin (Universidad de Oslo, Noruega) se centró en los casos con EC en los que persisten los síntomas intestinales a pesar de realizar correctamente la dieta sin gluten. Para ellos se ensaya desde hace un tiempo la dieta baja en carbohidratos fermentables (FODMAP). Esta dieta fue ideada por la Universidad de Monash, en Australia, para tratar el síndrome de intestino irritable, una dolencia que afecta a entre un 4% y un 15% de la población total, principalmente mujeres, en las que las pruebas médicas siempre son normales. Las guías de salud del Reino Unido recomiendan en estos casos comer sano y reducir el estrés, y si con eso no es suficiente aconsejan también dieta baja en FODMAP. La EC lleva asociadas con frecuencia (hasta en un 58% de los casos) otras patologías, como la diabetes tipo 1, la artritis reumatoide o el síndrome de Sjögren. El síndrome de intestino irritable es otro de los posibles trastornos asociados, y es por ello que se ha postulado la dieta baja en FODMAP para tratar estos casos una vez verificado que la dieta sin gluten es correcta. Si bien es cierto que ya está comprobado que tiene un efecto beneficioso en los síntomas intestinales, está por ver cuáles son las consecuencias de una dieta sin gluten baja en FODMAP a largo plazo en el estado nutricional y en la composición de la microbiota intestinal, por lo que por ahora es aconsejable que este tipo de intervenciones se lleven a cabo en un entorno clínico y bajo supervisión médica.

Buceando en la patogenia de la enfermedad

La Dra. Barbara Lexhaller (Universidad Técnica de Munich, Alemania) mostró sus estudios sobre la interacción entre el gluten y la enzima transglutaminasa tisular (TG2). Se trata de una enzima que puede actuar sobre las proteínas de dos maneras, realizando enlaces entre distinas proteínas o distintas regiones dentro de una misma proteína, mediante la reacción de transamidación, o bien transformando aminoácidos de glutamina en aminoácidos de ácido glutámico, mediante desamidación. Que se produzca una u otra depende de la acidez (pH) del medio y ambas requieren la presencia de calcio. La reacción de desamidación es la que provoca que el gluten sea más tóxico para las personas celíacas, ya que esta proteína contiene muchos aminoácidos de glutamina que, al ser transformados en ácido glutámico por la TG2, hacen que el gluten sea mejor reconocido por las células inmunitarias y se desencadene la reacción adversa típica de la EC. Pero la reacción de transamidación también es relevante, porque la propia enzima TG2 puede provocar que el gluten quede enlazado a ella y los complejos proteicos que se forman pueden ser diana de los anticuerpos que generan los pacientes. La investigación de la Dra. Lexhaller ha identificado 15 complejos proteicos de este tipo que contienen unas 20 secuencias proteicas potencialmente alergénicas.

Por otro lado, la estrecha relación entre la EC y la diabetes tipo 1 hace pensar que pueden tener desencadenantes parecidos, tema que centra las investigaciones de la Dra. Valentina Discepolo (Universidad Federico II de Nápoles, Italia). La incidencia de ambas enfermedades se ha duplicado en las dos últimas décadas, sin que haya variado la frecuencia de las variantes genéticas que predisponen a ellas, por lo que dicho incremento se atribuye a factores ambientales relacionados con cambios en la alimentación, en la composición de la microbiota intestinal o a infecciones virales. Lo cierto es que las dos enfermedades llevan aparejada una alteración de la barrera intestinal que favorece los procesos inflamatorios y autoinmunes. En el caso de la EC, estos procesos están protagonizados por la liberación de sustancias proinflamatorias como los interferones tipo 1 y la interleuquina 15 (IL-15), implicados en la pérdida de tolerancia inmunológica frente al gluten, lo que a su vez se ha asociado con ciertas infecciones virales. En el caso de la diabetes tipo 1 también están elevados estos interferones y la IL-15, y se investiga si la reacción autoinmune que sufren las personas diabéticas en el páncreas guarda alguna relación con esta alteración intestinal y si el gluten y las infecciones virales tienen algún papel en ello por un mecanismo similar al descrito en la EC, ya que el péptido de gliadina p31-43 es capaz de alterar la permeabilidad intestinal e inducir procesos inflamatorios.

Descubriendo nuevas opciones terapéuticas

La Dra. Carmen Gianfrani (Instituto de Bioquímica y Biología Celular de Nápoles, Italia) presentó la investigación preclínica con una nueva enzima capaz de degradar el gluten y candidata, por tanto, para el desarrollo de una futura terapia para tratar la EC. Se trata de la endoproteasa E40, perteneciente la familia de las sedolisinas, que se caracterizan por su capacidad para actuar a pH ácido, y que procede de bacterias del género Actinoallomurus. Los estudios de laboratorio han demostrado que es resistente a las enzimas digestivas del estómago (pepsina y tripsina), que su actividad es óptima en el rango de pH 4-6 y que degrada con gran rapidez (1 hora a pH 5) el péptido de gluten más resistente a la digestión humana y más tóxico para las personas celíacas, el péptido 33mer, derivado de la gliadina alfa2. También digiere con gran eficacia el gluten completo y así lo atestiguan tanto el análisis del producto de la digestión con el anticuerpo G12, que no detecta rastro de fragmentos tóxicos de gluten, como los ensayos funcionales realizados con células T CD4+ obtenidas de pacientes celíacos, que no se activan en presencia de los restos de la digestión, lo que corrobora la ausencia de toxicidad. La digestión de pan, pasta y cerveza en un sistema digestivo artificial que simula el aparato digestivo humano con sus diferentes compartimentos muestra igualmente la capacidad detoxificadora de esta enzima, al no detectarse fragmentos tóxicos de gluten en lo que sería el duodeno utilizándose métodos inmunológicos como los ensayos ELISA tipo sándwich y competitivo o métodos protémicos como la espectrometría de masas.

Este tipo de terapias persiguen, más que sustituir a la dieta sin gluten, evitar los riesgos de ingestas accidentales de gluten, algo a lo que se exponen con frecuencia las personas celíacas, especialmente cuando comen fuera de casa. El Dr. Knut Lundin (Universidad de Oslo, Noruega) comentó lo difícil que es conocer el umbral de tolerancia de cada persona ya que es muy difícil determinar la cantidad real de gluten que consumen los pacientes en su día a día, aunque numerosos estudios prueban que pequeñas trazas de gluten consumidas de forma habitual son suficientes para dañar la mucosa intestinal. Estudios de provocación que han administrado cantidades variables de gluten (10 mg, 50 mg, 100 mg, 500 mg) a pacientes celíacos durante varios días muestran que hay pacientes extremadamente sensibles.

Mejorando el análisis de gluten en alimentos

El Dr. Thomas Weiss (Laboratorio R-Biopharm, Darmstadt, Alemania) y la Dra. Katharina Scherf (Instituto de Ciencias Aplicadas del Instituto Tecnológico Karlsruhe de Munich, Alemania) presentaron los resultados del tercer estudio colaborativo, realizado en 2020, para evaluar el método de análisis de gluten en alimentos RIDASCREEN Gliadin R7001, de la compañía R-Biopharm, en diferentes tipos de alimentos. Los dos estudios previos, de 2012 y 2016, se centraban en el análisis de alimentos sin gluten basados en harina y arroz, materias primas para las cuales el test había sido validado y aprobado. En este caso se trataba de comprobar si el método es igualmente válido para una amplia variedad de productos y materias primas, con el fin de evitar tener que hacer validaciones adicionales o restringir las indicaciones de uso. En el trabajo participaron el propio laboratorio R-Biopharm y 14 laboratorios externos de Alemania, Austria, Italia, Finlandia, Irlanda, Canadá y Estados Unidos. En total, se les remitió para analizar 19 muestras de productos sin gluten seleccionados en función de su riesgo de contaminación, popularidad entre los consumidores y cantidad consumida por la población con EC.

Las muestras fueron contaminadas con cantidades conocidas de gluten en forma de proteína pura (suministrada por el Prolamin Working Group) o como harina de trigo, suministrada por la asociación MoniQA. Se trataba de comprobar la capacidad del test para detectar y cuantificar el gluten añadido en las diferentes muestras y la fiabilidad del análisis en base al grado de concordancia de los resultados obtenidos en los diferentes laboratorios. Las muestras analizadas incluían productos no procesados (harina de soja y varias mezclas de almidones, pseudocereales, legumbres y especias) y productos procesados a diferentes temperaturas (zumos multivitaminas, cremas, salsas, postres, caramelos, carne y sustitutos vegetarianos de la carne, chocolate, galletas, pan). Los resultados fueron bastante buenos para casi todas las muestras, tanto si estaban contaminadas con gluten o con harina de trigo. Las mayores discrepancias se obtuvieron con el zumo multivitaminas, tal vez por problemas de solubilidad o agregación de componentes durante el proceso de extracción del gluten, y en el chocolate, posiblemente por el efecto del calor sobre el gluten al elaborarlo, o por la generación de polifenoles, que interfieren en el análisis.

Por su parte, la Dra. Cristina Romero (Laboratorios Eurofins, Madrid, España) presentó los primeros resultados del test SENSISpec INgezim Hydrolized Gluten R5, especialmente diseñado para analizar gluten en productos hidrolizados como la cerveza, el sirope y los alimentos infantiles. El método, que aún no ha sido validado para su uso en la industria, es un inmunoanálisis ELISA de tipo directo que ofrece resultados equiparables al ELISA tipo competitivo y superiores al ELISA tipo sándwich. El tiempo de análisis es muy corto, entre 60 y 100 minutos, según la muestra sea líquida o sólida,  y detecta a partir de 0,25 mg de gluten por kilo (0,25 partes por millón, ppm). Su uso comercial requiere ser validado en estudios colaborativos y aprobado por los organismos reguladores.

El problema al analizar productos hidrolizados es que cuando el gluten está muy fragmentado puede escapar a los métodos analíticos pero preservar aún su toxicidad y ser detectado por el sistema inmunitario de los pacientes. Los métodos recomendados actualmente para este tipo de productos, los ensayos ELISA tipo competitivo o directo, detectan menos toxicidad que métodos más sofisticados como la espectrometría de masas, lo que lleva a ser cautos. De hecho, la legislación estadounidense no permite etiquetar "sin gluten" cervezas elaboradas a partir de cebada. En la Unión Europea, sin embargo, sí está permitido a raíz de estudios internacionales que concluyen que sí son seguras. Esta problemática, expuesta por la Dra. Katharina Scherf (Instituto de Ciencias Aplicadas del Instituto Tecnológico Karlsruhe de Munich, Alemania), es la que ha motivado que se inicie el proyecto ImmunoSafe CeD, que investigará si la toxicidad detectada por los métodos vigentes en productos fermentados como la cerveza se refleja en toxicidad real para los pacientes.

Avanzando en los aspectos legales

El estado de la normativa sobre etiquetado sin gluten y métodos de análisis para la seguridad alimentaria de los productos sin gluten fue presentado, como es habitual, por Hertha Deutsch (Asociación de Celíacos de Austria, Viena), representante de la Asociación de Celiacos de Europa (AOECS) en las reuniones del Codex Alimentarius en calidad de observadora. En el comité para el etiquetado de alimentos (CCFL, Codex Committee on Food Labelling) se sigue trabajando en el etiquetado de alérgenos (ya en vigor) y en el etiquetado precautorio de alérgenos, el relativo a las trazas, aún poco definido. Y se han propuesto cambios en las definiciones que recoge la normativa sobre las reacciones adversas a alimentos, de forma que la enfermedad celíaca quedaría en un apartado nuevo reservado a reacciones de hipersensibilidad no mediadas por inmunoglobulina E (IgE), diferenciándola de las alergias alimentarias, que no tienen nada que ver con la EC, ya sean mediadas o no mediadas por IgE, ni con las intolerancias alimentarias, que no tienen ninguna base inmunológica. Por otro lado, se emplaza a 2023 la decisión de excluir la avena de los cereales que contienen gluten. Y el comité de nutrición y alimentos para dietas especiales (CCNFSDU, Codex Committee on Nutrition and Foods for Special Dietary Uses) se mantiene a la espera de que concluyan las investigaciones que tratan de determinar cuál es el mejor método para analizar gluten en alimentos. Actualmente sigue en vigor el ensayo inmunológico ELISA basado en el anticuerpo R5.

Autor: Juan Ignacio Serrano Vela. Doctor en Biología. Servicio de Investigación y Formación de la Asociación.