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La compañía R-Biopharm, con sede en la ciudad alemana de Darmstadt y principal productora mundial del único método aceptado para el análisis de gluten en alimentos, el inmunoensayo ELISA R5, fue la anfitriona de la 37ª reunión del Grupo de Trabajo sobre Análisis y Toxicidad de las Prolaminas, celebrada del 26 al 28 de septiembre de 2024. En ella que se expusieron las novedades sobre métodos analíticos y aspectos clínicos de la enfermedad celíaca.

Métodos analíticos de gluten en alimentos

El Dr. Thomas Weiss (R-Biopharm, Darmstadt, Alemania) expuso los métodos de análisis de gluten comercializados actualmente por la compañía y el nuevo método en el que están trabajando para mejorar el rendimiento y fiabilidad de estos análisis.

El inmunoensayo ELISA R5 tipo sándwich (R5 Gliadin) es el método de referencia aceptado legalmente para el análisis de gluten en alimentos y permite detectar y cuantificar la fracción de gluten de trigo, cebada y centeno que es soluble en alcohol, las gliadinas, principales responsables de la toxicidad para las personas con enfermedad celíaca (EC). El resultado requiere ser multiplicado por 2 para ofrecer el contenido total de gluten en una muestra, asumiendo que el contenido en gluteninas (fracción de gluten insoluble en alcohol y no detectada por el anticuerpo R5) es similar al de gliadinas.

Por su parte, el inmunoensayo ELISA R5 tipo competitivo (R5 Gliadin competitive) está especialmente indicado para muestras que contienen gluten altamente degradado (hidrolizado) y el resultado sobreestima el contenido en gluten cuando la muestra contiene cebada o centeno. Existen, además, variantes inmunocromatográficas de este método (R5 FAST Gliadin y R5 FAST Gliadin sensitive) que ofrecen el resultado en menos tiempo (30 minutos, frente a los 90 minutos del tipo sándwich o los 40 minutos del tipo competitivo).

En los últimos años se ha desarrollado y aprobado un nuevo ensayo (R5 Total Gluten) que detecta y cuantifica el contenido total de gluten (gliadinas y gluteninas), combinando el anticuerpo R5 (específico frente a las gliadinas) con anticuerpos específicos contra las gluteninas. En este caso el resultado es directo, no requiere factor multiplicador, y sobreestima ligeramente el contenido de gluten cuando hay centeno en la muestra. Existe también una versión inmunocromatográfica (QUICK Gliadin) que ofrece un resultado cualitativo (positivo o negativo) en 5 minutos, frente a los 50 minutos que requiere el test cuantitativo.

En estos momentos está en proceso de aprobación el último método en el que están trabajando (R5 EASY Gluten). El resultado no requiere factor multiplicador para estimar la cantidad total de gluten, que puede ser sobreestimada si la muestra contiene cebada o centeno, y puede dar un falso positivo por reacción cruzada en bebidas de soja (no así en harinas de soja). Existe igualmente una versión rápida de tipo inmunocromatográfico.

Uno de los puntos críticos en el análisis de gluten en alimentos es el método de extracción de gluten de la muestra, al ser una proteína altamente compleja, insoluble en agua, que requiere diferentes combinaciones de alcoholes y agentes químicos reductores para lograr solubilizarla para efectuar un análisis fiable.

Otro punto crítico es el factor multiplicador necesario para estimar el contenido total de gluten, que según el Dr. Weiss debería ser 1,5 en vez de 2 cuando el método detecta gliadinas, cuya proporción estimada frente a las gluteninas no es 1:1 sino más bien 2:1.

También es relevante la muestra de referencia utilizada para calibrar los diferentes tests, cuyo contenido en gluten es conocido de antemano y debe ser representativa del gluten que vaya a estar presente en cualquier muestra que sea objeto de análisis. La dificultad de crear una muestra estándar de gluten suficientemente representativa provoca que diferentes tests ofrezcan diferentes resultados cuando analizan una misma muestra.

Los tests más antiguos empleaban un cóctel de extracción basado en alcoholes y agentes reductores como el beta-mercaptoetanol, que resulta tóxico para el operador, necesario para desnaturalizar las proteínas (rompe los puentes disulfuro que se generan con el calor durante el cocinado de alimentos). Además, eran calibrados con el material de referencia PWG-Gliadin desarrollado por el WGPAT y requerían de un factor multiplicador para estimar la cantidad total de gluten de la muestra. El último método desarrollado, R5 EASY Gluten, utiliza un nuevo cóctel de extracción, desarrollado por la Asociación MoniQA, encargada también de suministrar un material de referencia alternativo para la calibración, y no requiere factor multiplicador.

Otros puntos críticos tienen que ver con la sensibilidad y especificidad de los anticuerpos empleados en estos métodos para detectar la cantidad de gluten en una muestra, que puede estar sobreestimada cuando contiene restos de diferentes cereales con gluten o dar falsos positivos por reacción cruzada con sustancias diferentes del gluten. También el efecto de los procesos de cocinado y la digestión de los alimentos, que pueden hacer variar la toxicidad de la muestra que finalmente llega al intestino delgado en comparación con la materia prima original o con el alimento cocinado antes de ingerirlo.

El efecto de la digestión está siendo estudiado por la Dra. Kim Lorenz (Universidad Técnica de Munich, Alemania) a partir de muestras de pan y harina de trigo digeridas artificialmente en el laboratorio con diferentes enzimas digestivas (pepsina, tripsina, quimiotripsina, elastasa). Una vez optimizado este proceso digestivo simulado, se obtienen péptidos de gluten de entre 6 y 14 aminoácidos que pueden ser identificados mediante espectrometría de masas. Los resultados preliminares muestran que en condiciones de digestión no óptimas (equiparables a la digestión humana) hay una media de 6-7 potenciales puntos de corte en los fragmentos proteicos sobre los que no han llegado a actuar las enzimas digestivas.

Análisis de cervezas sin gluten

En la misma Universidad, la Dra. Eleonora Tissen se centra en el estudio de las cervezas sin gluten. Tras analizar por espectrometría de masas el contenido en gluten de 23 cervezas sin gluten etiquetadas y comercializadas como tales por contener menos de 20 mg gluten/kg según la legislación vigente, identificó en total 75 péptidos de gluten. 29 eran detectados sólo por el anticuerpo R5, 1 era detectado sólo por el anticuerpo G12 y 17 no eran detectados por ningún anticuerpo a pesar de estar descrita su toxicidad para personas con EC. 4 péptidos de reconocida toxicidad eran detectados por ambos anticuerpos y otros 23 por R5. De las cervezas analizadas, 22 estaban elaboradas a partir de cebada (una de ellas incluía trigo) y 1 a partir de  centeno. Se desconoce la relevancia clínica de estos hallazgos.

Toxicidad del gluten de cebada hidrolizado

Se sabe que el consumo de gluten en personas con EC que están a dieta sin gluten provoca la elevación de anticuerpos específicos en sangre a las 2 semanas de la ingesta, la activación de células inmunitarias T CD4+ y CD8+, detectables en sangre a los 6 días, y la producción de citoquinas proinflamatorias como la IL-2, detectable en sangre tan solo 4-6 horas después de la ingesta.

La Dra. Nancy Odden (Universidad de Oslo, Noruega) está estudiando el efecto de la ingesta de gluten hidrolizado de cebada a dosis altas y a dosis bajas en los niveles de IL-2 en sangre. El gluten de cebada hidrolizada se obtiene por digestión enzimática o por los procesos naturales de fermentación y malteado, y se emplea para mejorar las características sensoriales de ciertos alimentos. Estos procesos no garantizan la hidrólisis completa del gluten y es la seguridad de estos alimentos lo que está en cuestión.

En el estudio participan 22 pacientes que se someterán a una prueba de provocación corta en la que consumirán una mezcla de leche con cacao, sin lactosa y baja en FODMAP, a la que se añadirá una u otra cantidad de gluten hidrolizado de cebada, según las dosis establecidas, para evaluar su efecto. La cebada utilizada en el ensayo procede de una región en la que se lleva cultivando de manera exclusiva desde hace más de 50 años, lo que garantiza la ausencia de contaminación con trigo o centeno. Algunos pacientes consumirán en su lugar una mezcla con gluten de trigo para determinar si el efecto es diferente. En este caso, las harinas de trigo utilizadas sí pueden estar contaminadas con cebada o con centeno. Las harinas comerciales de trigo suelen contener un 5% de centeno y un 1-2% de cebada.

Esta investigación forma parte del proyecto europeo IMMUNOSAFE CeD, en el que están involucrados equipos de investigación de Alemania, Noruega e Italia y que persigue desarrollar métodos analíticos que determinen de forma fiable la seguridad de alimentos que incorporan gluten parcialmente hidrolizado para las personas con EC.

Mejora de cereales con gluten para reducir su toxicidad

La obtención de nuevas variedades de plantas por métodos tradicionales lleva mucho tiempo, ya que los resultados de los cruzamientos son poco precisos y requieren múltiples generaciones. Por ejemplo, obtener una nueva variedad de manzana puede requerir hasta 20 años, estimándose que sólo 1 de cada 15.000 semillas obtenidas de los cruzamientos reunirá las cualidades deseadas.

En el caso de los cereales con gluten, la complejidad de esta proteína y la cantidad de genes implicados en su síntesis hacen inviable obtener variedades con baja toxicidad por métodos tradicionales, por lo que es necesario recurrir a técnicas más sofisticadas que expuso el Dr. René Smulders (Universidad de Wageningen, Países Bajos).

A lo largo del siglo XX se introdujeron nuevos métodos para acelerar la obtención de nuevas variedades de plantas, como la inducción de mutaciones con métodos físicos o químicos en la década de 1930 o la ingeniería genética para obtener organismos modificados genéticamente (OMG) en la década de 1980, que permitía introducir genes usando como vector bacterias del género Agrobacterium.

La regulación de los OMG es muy estricta, especialmente en la Unión Europea (UE), en la que sólo está autorizado, por ejemplo, el cultivo de una variedad de maíz transgénico, concretamente en España, que es resistente a plagas, mientras que sí está permitida la importación de maíz y soja transgénicos resistentes a plagas y a herbicidas para alimentación animal o algodón transgénico resistente a plagas que tienen autorizado su cultivo fuera de la UE.

El siglo XXI trajo nuevas técnicas de modificación genética, como la mutagénesis dirigida, el ARN de interferencia o la edición genética CRISPR/Cas9, cuyas aplicaciones y condiciones de uso en la mejora de plantas está actualmente en proceso de regulación por parte de la Comisión Europea.

Exposición al gluten en la vida real

La Dra. Chiara Monachesi (Universidad Politécnica de las Marcas, Ancona, Italia) plantea si la cantidad de gluten considerada segura para las personas con EC, entre 10 y 50 miligramos totales al día, realmente lo es. Estudios recientes han demostrado que la ingesta de 3 miligramos de gluten al día

provoca la elevación de IL-2 en sangre, un marcador temprano de activación inmunitaria que se investiga como indicador de EC en casos no confirmados que ya se encuentran a dieta sin gluten y que elevarían este marcador tras una prueba de provocación corta, de tan solo 1 día.

En estudios previos de su grupo de investigación se analizaron 200 productos alimenticios, 66 cosméticos y la comida de 69 pacientes pediátricos con EC en busca de restos de gluten.

En el caso de los menús infantiles, sólo se detectó gluten en el 3% de las muestras. Todas ellas correspondían a una sola familia y sólo una de las muestras positivas excedía el límite de los 20 mg gluten/kg (20 partes por millón, ppm).

Los resultados del análisis de productos alimenticios, que incluían productos libres de gluten por naturaleza, con o sin declaración de trazas, y productos procesados, con o sin certificación sin gluten, también ofrecieron resultados bastante satisfactorios. De los 200 productos analizados, 18 (9%) excedían las 20 ppm de gluten (sin llegar a las 100 ppm) y 9 (4,5%) contenían entre 10 y 20 ppm de gluten, estando las 173 restantes (86,5%) por debajo de las 10 ppm.

En cuanto a los cosméticos analizados, que incluían 37 pastas de dientes, 2 tabletas limpiadoras, 5 enjuagues bucales, 10 bálsamos labiales y 12 pintalabios, sólo se detectó gluten por encima de las 20 ppm en 4 (6%): 3 pastas de dientes y 1 pintalabios. Ningún cosmético analizado incluía ingredientes derivados de cereales con gluten, por lo que el gluten estaba presente por contaminación.

Actualmente está participando en un estudio internacional, The Pizza Study, en el que colaboran 11 centros de investigación de 9 países que están analizando pizzas sin gluten de establecimientos de hostelería. De las 98 muestras analizadas hasta la fecha, 83 han resultado negativas, 14 contenían entre 5 y 20 ppm de gluten y 3 superaban las 20 ppm de gluten, dos en Italia (50 y 58 ppm, respectivamente) y una en Suecia (29 ppm). Se da la circunstancia de que ninguno de los establecimientos en los que se superaba el límite legal (20 ppm) estaba asesorado por la asociación de celíacos local, y al menos en uno de ellos se identificó como principal causante de la contaminación el hecho de compartir la pala con la que se introducían las pizzas con y sin gluten en el horno. Un estudio similar realizado en Estados Unidos detectó contaminación con gluten en el 38% de las muestras.

Adherencia a la dieta sin gluten

Es sabido que un porcentaje relevante de pacientes con EC consumen gluten de manera inadvertida, de forma que el paradigma de la dieta estricta sin gluten de por vida, único tratamiento eficaz para la EC, lo cumple, según diferentes estudios, el 40% de los pacientes en Argentina, el 49% en Australia, el 66%-92% en Estados Unidos, el 67%-88% en el Reino Unido o el 89% en Canadá. Así lo expuso el nutricionista Nick Trott (Hospital Royal Hallamshire de Sheffield, Reino Unido), quien enfatiza que no existen verdaderas diferencias clínicas, analíticas o histológicas entre pacientes que cumplen o incumplen la dieta sin gluten, estimándose que aquellos que la incumplen ingieren, en promedio, 185 gramos de gluten al año, con al menos una ingesta semanal o mensual.

En el otro extremo se encuentran los pacientes que a pesar de realizar la dieta sin gluten de manera estricta sí experimentan síntomas o llegan a sufrir algún tipo de daño intestinal. Los 50 miligramos de gluten al día que se demostró que son tolerados por la mayoría de las personas con EC, según un estudio de 2007, pueden ser demasiado para pacientes catalogados como hipersensibles al gluten. El mismo estudio de 2007 demostró que algunos pacientes recaen con tan solo 10 miligramos de gluten al día, y se ha reportado algún caso de recaída tras la ingesta de 1 miligramo de gluten al día, al consumir obleas para la comunión. Para casos como este se recomienda una dieta sin gluten ultra estricta, a base de alimentos naturales o muy poco procesados.

Monitorización de la dieta sin gluten

Desde 2017 se han realizado más de una treintena de estudios sobre el uso de los novedosos tests de detección de péptidos tóxicos de gluten (GIP, Gluten Immunogenic Peptides) en heces y orina como prueba de la ingesta de gluten. De ello habló el Dr. Knut Lundin (Universidad de Oslo, Noruega), quien afirmó que la presencia de fragmentos proteicos en la orina es un hecho conocido y ya en 1998 se había demostrado que la excreción de péptidos era mayor en niños con EC o con autismo que en niños sanos, lo que reflejaba muy probablemente una alteración de la permeabilidad intestinal, y se reducía tras el inicio de la dieta sin gluten. Más tarde se demostró que parte de esos péptidos derivaban del gluten, y lo más llamativo es que los péptidos de gluten excretados por pacientes con EC son diferentes de los excretados por personas sanas, lo que sugiere una diferente digestión del gluten.

El análisis de GIP en heces u orina para el control de la dieta sin gluten es aún controvertido. No está claro cómo actuar ante un resultado positivo en ausencia de síntomas o daño intestinal. Si se confirma la persistencia de lesión intestinal, entra en juego el papel de dietistas-nutricionistas con experiencia en el tema, y de grupos de apoyo para fortalecer la educación de los pacientes. Por otro lado está el impacto psicológico que puede acarrear la hipervigilancia, sin ignorar el coste económico si se emplean de manera rutinaria, en Noruega está alrededor de los 100€ por test.

No hay ningún método que por sí solo sea infalible para detectar transgresiones. Los cuestionarios dietéticos, como el CDAT (Celiac Disease Adherence Test), están diseñados para detectar comportamientos de riesgo más que exposición a gluten, y además fue desarrollado para su uso en Estados Unidos, en Europa no funciona, según el Dr. Lundin.

Novedades en la patogenia de la EC

Se sabe que los enterocitos expresan moléculas HLA de clase II pero se desconoce si este hecho tiene alguna implicación en la patogénesis de la EC. Los modelos que describen actualmente la patogénesis de la EC asumen que los péptidos derivados de la digestión de gluten atraviesan el epitelio intestinal por diferentes vías y una vez dentro son detectados por células presentadoras de antígenos y presentados a través de moléculas HLA-DQ2 (también DQ8) a los linfocitos T CD4+, encargados de poner en marca la reacción inmunitaria adversa característica de la EC.

El Dr. Fernando Chirdo (Universidad Nacional de La Plata, Argentina) profundizó en este tema a raíz de las investigaciones realizadas por la investigadora Elena Verdú en la Universidad canadiense de McMaster, en Hamiliton. Sus trabajos con organoides derivados de modelos murinos de EC, una metodología novedosa para simular y estudiar el funcionamiento de órganos en el laboratorio, han comprobado que las proteínas HLA-DQ2.5 expresadas por los enterocitos pueden unir péptidos de gluten antes de que éstos hayan atravesado la pared intestinal y los complejos formados por esta proteína unida a los péptidos son internalizados y pueden llegar a interaccionar con los linfocitos T CD4+, se desconoce si de manera directa o por medio de exosomas liberados por los enterocitos.

Los modelos con organoides han demostrado que la inmunización con gluten incrementa la expresión de proteínas HLA-DQ2.5 en los enterocitos, mucho más si se realiza en presencia de interferón gamma. Se liberan, además, marcadores de activación temprana de linfocitos T como las moléculas coestimuladoras CD69, CD25 y CD44.

Las vías de entrada de péptidos de gluten a través del epitelio serían, por tanto, la paracelular (mayoritaria, a causa del aumento de permeabilidad intestinal que experimentan las personas con EC), la transcelular descrita en los enterocitos que internalizan gluten unido a HLA-DQ2.5 (minoritaria), a través de las células de Globet (internalizan gluten unido a IgA, vía CD79) y a través de las células M ubicadas en las placas de Peyer, que internalizan grandes partículas como pueden ser complejos formados por gluten unidos a la enzima transglutaminasa tisular.

El papel de los ATI en enfermedades inflamatorias

El Dr. Detlef Schuppan (Universidad de Mainz, Alemania) abordó la implicación de los inhibidores de amilasa y tripsina (ATI, Amylase Trypsin Inhibitors) en el proceso inflamatorio que rodea a la EC. Se trata de una familia de proteínas clasificadas en 7 grupos que están presentes en el grano de trigo y están implicadas en el proceso de maduración y en la resistencia a plagas.

Se estima que alrededor del 15% de las personas que consumen trigo sufre algún tipo de inflamación asociada la ingesta de este cereal, el 0,2% en forma de alergia alimentaria mediada por IgE, el 1%-2% en forma de EC, el 5% en forma de alergia alimentaria no mediada por IgE (causada por componentes proteicos diferentes del gluten) y el 10% en forma de sensibilidad a ATI.

Los ATI son resistentes al proceso digestivo humano y tienen la capacidad de activar las células inmunitarias de la mucosa intestinal a través de los receptores TLR4 (cuya función primordial es detectar elementos superficiales de las bacterias como el LPS). Ello potencia procesos inflamatorios digestivos y extradigestivos en personas que ya tienen activa la inmunidad adaptativa por padecer alguna enfermedad autoinmune.

Actualmente se investiga el papel de los ATI, y de las dietas bajas en ATI, en enfermedades crónicas como la esclerosis múltiple, el lupus eritematoso sistémico, la artritis reumatoide, la esteatosis hepática no alcohólica (MASLD) o la fiebre mediterránea familiar. En modelos de esclerosis múltiple en ratones, el consumo de ATI promueve la autoinmunidad contra componentes del sistema nervioso central, y en modelos de MASLD también en ratones promueven la inflamación del tejido adiposo.

Los ATI son por tanto considerados agentes potenciadores de procesos inflamatorios activos y su efecto depende de la dosis ingerida. En humanos, una dieta estándar, en la que la que los alimentos basados en trigo suponen un 30% de la ingesta diaria, implica el consumo de 1 gramo de ATI al día. Un ensayo realizado en pacientes con esclerosis múltiple muestra su mejoría con una dieta baja en ATI. La restricción no requiere ser completa o estricta, basta con reducir la ingesta de ATI en un 90%.

El Dr. Schuppan plantea si es apropiado recomendar dieta  baja en ATI (dieta baja en trigo, y por tanto baja en gluten) en personas con enfermedades crónicas de naturaleza inflamatoria o metabólica. Sugiere ensayarla 4 semanas y mantenerla si se objetiva mejoría.

Ensayos clínicos con fármacos para la EC

El Dr. Schuppan repasó también los fármacos experimentales que se ensayan como tratamiento para la EC. La justificación para el desarrollo de fármacos es que la ingesta accidental de pequeñas cantidades de gluten puede tener consecuencias hasta en un 30% de pacientes. Destacó también que un tercio de las personas afectadas por la EC padecen alguna otra enfermedad autoinmune.

Las estrategias terapéuticas en marcha incluyen enzimas glutenasas que destruyen los péptidos tóxicos del gluten, como AN-PEP, la latiglutenasa (ALV003) o la zamaglutenasa (TAK062), estabilizadores de la permeabilidad intestinal que impiden la entrada de péptidos tóxicos de gluten a través de la pared intestinal, como el larazótido o IMU856 (agonista de SIRT6), inhibidores de la transglutaminasa tisular como TAK227 (ZED1227), que impiden que esta enzima actúe sobre los péptidos de gluten incrementando su toxicidad, fármacos biológicos como el inmunosupresor Amlitelimab (anti OX40L) o los dirigidos contra la IL-15 (PRV, CALY002) o inmunomoduladores como la vacuna NexVax2 o las nanopartículas tolerogénicas TAK101, KAN101 y TPM502.

Si bien los ensayos con el larazótido y NexVax2, que parecían prometedores, han sido abandonados, el resto están en marcha en este momento o tienen pendiente reanudar nuevos ensayos con pacientes. El Dr. Schuppan se centró en el fármaco TAK062 (ZED227), en el que está involucrado, que en su fase 2a se ensayó en 160 pacientes a los que se administraron 3 gramos de gluten al día durante 6 semanas junto con diferentes dosis del fármaco (10 mg, 50 mg, 100 mg) o un placebo, y en su fase 2b, ahora en marcha, se está ensayando en pacientes a dieta sin gluten con persistencia de síntomas.

Autor: Juan Ignacio Serrano Vela. Doctor en Biología. Servicio de Investigación de la Asociación.